mRNA疫苗巨头的超滤工艺及其原理
mRNA作为预防和治疗产品的需求日益增长，需要高效和可扩展的纯化步骤才能达到临床药用标准，其高效纯化仍然是一个挑战。
通过体外转录反应（IVT）合成的mRNA，其反应混合物不仅含有所需的mRNA产物，还含有包括酶（RNA聚合酶、磷酸酶）和模板DNA，以及IVT期间形成的mRNA副产物（主要包括dsRNA和截断的RNA片段）等一些杂质，研究和实验室规模的纯化通常采用DNA酶切加氯化锂(LiCl)沉淀的方法。然而该方法不能去除dsRNA和截短的RNA片段，它们的存在会刺激异常的免疫信号通路，降低目的mRNA翻译效率。大规模生产中，目前首选层析结合切向流过滤的方法。常用于mRNA纯化的层析法包括体积排阻层析、反相离子对层析、离子交换层析、疏水层析、亲和层析等。
体积排阻层析法(Size exclusion chromatography, SEC)是根据体积大小分离纯化RNA分子，SEC填料具有一定孔径范围，大分子因无法进入孔内而先流出层析柱，小分子后流出。SEC快速液相层析法可应用到制备规模的纯化过程，实现高纯度和高产率。首次发表的大规模RNA的纯化方案中使用了该方法，SEC的局限性在于不能去除分子大小相近的杂质（如dsDNA）。
反相离子对层析(Ion pair chromatography，IPC)是利用mRNA上带负电荷寡核糖核苷酸-磷酸主链与流动相中的季铵盐化合物(三乙基醋酸铵)配对，成为亲脂性化合物，可以与反相层析柱的固定相相互作用，用适当的溶剂(如乙腈)进行梯度洗脱，该方法可以有效地去除dsRNA、截短RNA片段和DNA杂质，同时保持工艺的高收率。然而，IPC推广成本高昂，且药物生产中不宜使用乙腈等有毒试剂。
离子交换层析法（Ion Exchange Chromatography，IEC）利用目标mRNA和不同杂质之间的等电点不同带来的电荷差异进行mRNA纯化。与IPC相比具有更高的结合能力，其中弱阴离子交换层析法已经成功应用到大规模mRNA纯化过程。IEC可扩展，可用于大规模纯化，成本效益高，可以分离较长的RNA转录本。
疏水层析法（Hydrophobic interaction chromatography，HIC）利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的mRNA上疏水核苷酸残基发生可逆性结合而进行分离的方法，也是可用于RNA纯化的有效方法。选择合适的结合盐处理后，IVT混合物中DNA和dsRNA将无法结合层析柱而被除去，截短的RNA片段会在完整的ssRNA之前洗脱出来，NaOH用于去除大部分蛋白质类杂质。此方法放大有难度。
亲和层析（Affinity chromatography）是利用mRNA上多聚腺苷酸（poly-A）尾巴可以通过氢键作用与层析固定相耦合的poly dT链结合来捕获mRNA，而IVT未消耗的试剂(NTP等)、DNA模板和dsRNA都可以被有效地去除。该方法允许高流速，可以在非常短的时间内实现高回收率的mRNA纯化，但不能区分dsRNA和截短型RNA片段。
不同的层析模式均可用于核酸的纯化，层析可以提供好的可扩展性，提高自动化程度，减少对原料药的处理。由于其可选择性、多功能性、可扩展性和成本效益在制药行业被广泛接受。
切向流过滤（TFF）是一种压力驱动的，根据分子尺寸差异进行的膜分离过程，其过滤过程中液体流动方向与过滤方向垂直，通过多次再循环的方式，切向通过膜的表面。比膜截留分子量大的目标分子得到了保留，然而小分子和缓冲液通过了膜。IVT mRNA反应体系中除了大分子酶、模板DNA、mRNA副产物等以外，还含有许多小粒径杂质，如游离的NTP、Triton-X-100、帽类似物、氯化镁、Tris缓冲液等。这些小粒径杂质可通过切向流过滤（TFF）在浓缩或渗滤过程得到很好的去除。
mRNA的大规模纯化一般采用多种纯化步骤相结合的方式。2020年12月获得FDA的紧急使用授权的辉瑞btn162b2疫苗生产过程中mRNA的纯化采用了“切向流过滤（TFF1）—层析—切向流过滤（TFF2）”的过程。
1. 层析前的切向流过滤（TFF1）
选择截留分子量 (MWCO)为100 kDa的超滤膜，用10倍体积的水对IVT反应溶液进行洗滤纯化，称为TFF1，此步mRNA由于其大小而不能通过过滤器，滤液中将包括：DNase、磷酸酶、质粒DNA、游离的NTP、Triton-X-100、T7 RNA 聚合酶、帽类似物、氯化镁、Tris缓冲液、亚精胺和二硫苏糖醇，截留液中包括mRNA（单链和双链）和水，98%的mRNA将在截留液中被回收。
2. mRNA的层析
TFF1的产物被注入基于纤维素的快速蛋白质液相层析 (FPLC)，mRNA流穿过层析柱，dsRNA可以与纤维素填料结合而被除去。层析缓冲夜中含有16%的乙醇(体积比)、水、NaCl、EDTA和HEPES。16%的乙醇至关重要，更高的浓度会导致ssRNA也结合到层析柱上。该层析过程在4℃下进行，在不损害mRNA的完整性的前提下，可有效去除大小在21~ 500 bp之间的dsRNA。
3.mRNA层析后的切向流过滤（TFF2）
层析步骤之后dsRNA被去除，但同时在mRNA溶液中引入的HEPES、EDTA、氯化钠和乙醇，需要进行第二次的切向流过滤（TFF2）步骤去除这些杂质，同时进行缓冲液置换以用于下游的LNP制剂工艺。TFF2选择截留分子量为100 kDa的超滤膜，用10倍体积的50 mM的醋酸钠进行洗滤。TFF2的截留液包含单链mRNA和醋酸钠。
滤液中将包括：
HEPES、EDTA、氯化钠、乙醇和醋酸钠。mRNA在此步骤的回收率可达98%。
之后，mRNA使用0.2 µm膜过滤去除细菌和微生物污染物即可进行LNP的包装步骤。
1. Rosa SS, Prazeres DMF, Azevedo AM, Marques MPC. mRNA vaccines manufacturing: Challenges and bottlenecks. Vaccine. 2021 Apr 15;39(16):2190-2200.doi: 10.1016/j.vaccine.2021.03.038. Epub 2021 Mar 24. PMID: 33771389; PMCID: PMC7987532.
2.Labarta, S.Hoffman, A.Simpkins, Manufacturing Strategy for the Production of 200 Million Sterile Doses of an mRNA Vaccine for COVID-19. 2021
赛多利斯在TFF工艺方面具有丰富的产品组合，可提供全方位的解决方案，助力解决mRNA产品的纯化工艺需求。
通过Ambr®Crossflow（筛选5 mL – 500 ml /10 mg – 5 g），赛多利斯为平行筛选提供了高通量的解决方案。在mRNA产品早期开发阶段，Ambr® crossflow技术可以了解与膜工艺中粘度、缓冲成分、剪切应力和性能相关的分子行为，为最后确定候选物额外提供了很多重要的决策标准，大大加快这个流程。
表1 Ambr®crossflow系统简介
Sartoflow®Smart （开发20 mL – 5 L/0.5 g – 50 g）是工艺开发的理想切向流过滤系统。采用低剪切隔膜泵可获得更高的产品收率。
表2 Sartoflow® Smart 系统简介
可以配合使用的Hydrosart® 超滤膜包（图1）采用稳定化再生纤维素，具有超低蛋白吸附、易清洗、产率高、产品寿命长；即使反复使用，也能保持其性能，不容易结垢或失去截留能力。具有很强的化学耐受性、耐SIP和耐伽马辐照能力，易于清洗、消毒和蒸汽灭菌。不同规模的膜包见表3：
图1 Hydrosart® 超滤膜包
表3 Hydrosart®超滤膜包规格
同时，赛多利斯可以为各生产规模mRNA的TFF纯化提供直观且易于操作的解决方案。图2为Sartoflow®一次性TFF系统平台，各规模的TFF均有配套的一次性kit，配合使用可以消除清洁需求，缩短验证时间，实现批次之间的快速切换同时保持低污染风险，保证产品更快的上市。
图2 Sartoflow®一次性TFF系统平台
TFF在生物制药工艺过程中应用十分广泛，主要起到浓缩和缓冲液置换的目的。TFF技术贯穿整个mRNA药物生产工艺，如大肠杆菌的收获，pDNA模板的制备，mRNA的原液生产，以及最终LNP-mRNA的制剂生产等。Hydrosart材质膜包是基于天然亲水的再生纤维素稳定化改造而来，具有超低吸附、易清洗、回收率高、产品寿命长等特点，特别适合IVT mRNA的超滤浓缩和换液。同时其优良的耐伽马辐照能力也为其搭配一次性TFF系统使用成为可能。
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